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液态活檢研究進展及技術平台簡介
液态活檢（liquid biopsy）
液态活檢這(this)一(one)概念最早在(exist)1974年由Sorrells等提出(out)。液态活檢主要(want)檢測對象包括：循環腫瘤細胞(CTC)、循環腫瘤DNA(ctDNA)以(by)及腫瘤外泌體（exosome）等，它們(them)來(Come)源于(At)腫瘤組織，存在(exist)于(At)血液，可以(by)提示腫瘤發展進程及抗藥性等信息，指導個(indivual)體化精準治療。與現有腫瘤檢測方法相比，液态活檢無侵入性、可頻繁多次檢測及快速反應能力均體現出(out)顯著的(of)優勢，應用(use)發展潛力巨大(big)。從成本的(of)角度，醫療保險有較大(big)的(of)動力推動液态活檢的(of)CTC與ctDNA技術對穿刺活檢技術的(of)替代。癌症液态活檢也将幫助削減無效醫療開支、降低醫療成本、幫助醫保控費。
美國(country)紀念斯隆-凱特林癌症中心主任醫師兼首席醫療官約瑟·巴塞戈稱：“液态活檢可能永久改變活檢方式，包括對治療方案的(of)響應、抗藥性的(of)出(out)現，将來(Come)甚至還能用(use)于(At)早期診斷”。2015年2月白宮官網發布的(of)相關細節中，腫瘤治療計劃的(of)四大(big)舉措之一(one)就是(yes)：美國(country)将使用(use)“液态活檢”血漿開發新方法來(Come)評估治療反應以(by)及抵抗可能的(of)耐藥性。
根據中國(country)國(country)家癌症中心發布的(of)數據，我(I)國(country)5年内診斷爲(for)癌症且仍存活的(of)病例數約爲(for)749萬。液态活檢臨床實驗的(of)适應症廣泛，如乳腺癌、結直腸癌、肺癌、胃癌、食管癌等常見腫瘤均可用(use)液态活檢技術進行診斷與監測。在(exist)我(I)國(country)存量腫瘤患者中，适合使用(use)液态活檢技術的(of)腫瘤病人(people)至少爲(for)542萬人(people)，占比達到(arrive)72%。預計液态活檢的(of)目标患者人(people)數爲(for)500萬人(people)。在(exist)同時(hour)考慮我(I)國(country)腫瘤發病率、液态活檢适應症、未來(Come)市場滲透率、未來(Come)檢測單價以(by)及患者年平均檢測次數等因素後，預測中國(country)液态活檢市場在(exist)5-10年内的(of)市場潛力約爲(for)200億元。
液态活檢的(of)七大(big)應用(use)簡介：
1. 唐氏綜合征：到(arrive)目前爲(for)止，液态活檢的(of)主要(want)商業應用(use)是(yes)在(exist)懷孕期間。“無創産前檢測（NIPT）”通過分析母親血液來(Come)檢測唐氏綜合征。該檢測通常是(yes)對DNA片段進行計數，以(by)确定胎兒是(yes)否含有過多或過少的(of)染色體。若要(want)确診唐氏綜合征，仍需要(want)進行羊膜穿刺或絨毛膜取樣。
2. 罕見出(out)生(born)缺陷：NIPT不(No)僅能揭示額外染色體的(of)信息，也能讓你深入了(Got it)解胎兒基因組。它們(them)能定位DNA的(of)缺失，也就是(yes)微缺失（microdeletion），這(this)會引起罕見疾病。斯坦福的(of)研究人(people)員發現，他(he)們(them)能對母親血液中的(of)胎兒完整基因組進行測序。目前，液态活檢的(of)另一(one)個(indivual)研究方向是(yes)如何發現DNA差異，以(by)及單個(indivual)堿基的(of)突變，它們(them)引起了(Got it)單基因疾病，如囊性纖維化和(and)地(land)中海貧血。
3. 親子鑒定：檢測公司Natera及其合作(do)夥伴提供一(one)種液态活檢，可确定胎兒的(of)父親。這(this)項檢測可在(exist)懷孕9周時(hour)進行。在(exist)此之前，對胎兒做親子鑒定必須要(want)等到(arrive)懷孕15周。不(No)過，檢測時(hour)還需要(want)提供所有可能父親的(of)血液樣本。
4. 器官移植：腎髒、肝髒或心髒的(of)移植，也可被視爲(for)基因組移植。移植之後，含有其他(he)人(people)DNA的(of)細胞就出(out)現在(exist)受體的(of)體内。通過液态活檢來(Come)追蹤這(this)些DNA，可确定器官是(yes)否被排斥。太多捐獻器官的(of)DNA可能意味着它被受體的(of)免疫系統攻擊。對于(At)那些接受骨髓移植的(of)患者，液态活檢也被證明是(yes)有用(use)的(of)。
5. I型糖尿病：在(exist)I型糖尿病中，自身産生(born)胰島素的(of)β細胞中胰島素基因經曆了(Got it)脫甲基化改變而開啓；在(exist)其他(he)組織中，胰島素基因被甲基化而關閉。測序儀可測定DNA鏈是(yes)否甲基化，能夠大(big)緻追蹤多少DNA是(yes)從β細胞上(superior)脫落的(of)。
6. 癌症預測：液态活檢的(of)一(one)大(big)應用(use)将是(yes)在(exist)任何症狀出(out)現之前發現癌症。研究已經表明，血液檢測能在(exist)看到(arrive)腫瘤之前檢測到(arrive)它。以(by)便在(exist)長期吸煙者和(and)有家族風險的(of)人(people)群中發現早期癌症。
7. 癌症治療：通過血液中發現的(of)突變DNA片段，建立癌症的(of)遺傳圖譜。這(this)種“診斷和(and)治療”的(of)檢測可以(by)用(use)來(Come)确定哪些藥物适用(use)于(At)患者，因爲(for)癌症是(yes)由特定突變引起的(of)，它們(them)對某些藥物有很好的(of)響應。
另外，由于(At)血液中腫瘤DNA的(of)量與腫瘤的(of)大(big)小和(and)階段大(big)緻成比例，這(this)種檢測也可用(use)來(Come)判斷手術或藥物治療的(of)效果。對于(At)組織活檢難以(by)進行的(of)疾病，如肺癌，液态活檢特别有用(use)（圖1）。
圖1. 液态活檢在(exist)腫瘤（肺癌）中的(of)應用(use)
一(one)、液态活檢之循環腫瘤DNA研究進展及技術平台簡介
（一(one)）循環腫瘤DNA (ctDNA)簡介
血漿遊離循環腫瘤DNA (ctDNA)是(yes)由腫瘤細胞釋放到(arrive)血漿中的(of)單鏈或者雙鏈DNA，對ctDNA進行檢測，可以(by)對腫瘤負荷進行實時(hour)監控、藥物療效反應與預後判斷等。腫瘤細胞壞死或者凋亡後，細胞中的(of)DNA釋放進入循環系統，遊離地(land)存在(exist)于(At)血液當中（圖2）。雖然這(this)些DNA是(yes)斷裂的(of)，不(No)完整的(of)，但它來(Come)自于(At)腫瘤細胞，如果腫瘤細胞攜帶某種基因突變，這(this)些突變也能在(exist)ctDNA中反應出(out)來(Come)。通過檢測ctDNA的(of)基因突變，就可以(by)揭秘體内腫瘤組織的(of)突變信息，從而爲(for)腫瘤的(of)靶向治療和(and)藥效檢測提供依據。
圖2. 循環腫瘤DNA (ctDNA)來(Come)源
1948年，科學家第一(one)次報告了(Got it)人(people)體血液中存在(exist)DNA循環；1977年，明确提出(out)癌症患者血液中的(of)DNA循環。人(people)們(them)又花費17年時(hour)間指出(out)，這(this)些DNA出(out)現了(Got it)與癌症有關的(of)突變。血漿ctDNA直到(arrive)近來(Come)才取得臨床研究和(and)應用(use)的(of)進展，部分原因是(yes)腫瘤DNA比胎兒DNA更難探測。它在(exist)血液中的(of)含量非常少且極爲(for)多變。對患有晚期癌症的(of)患者而言，腫瘤可能是(yes)血流中循環DNA的(of)主要(want)來(Come)源，但ctDNA僅占總數的(of)1%，甚至少到(arrive)0.01%。早期測序技術還無法探測到(arrive)它1。
ctDNA可能比蛋白質生(born)物标識表現得更好。蛋白質被用(use)于(At)臨床疾病診斷，并對正在(exist)接受治療的(of)患者進行監控。例如，前列腺特異性抗原（PSA）是(yes)前列腺腫瘤的(of)生(born)物标識，但它卻會出(out)現假陽性結果，因爲(for)出(out)于(At)其他(he)原因，這(this)種抗原在(exist)血液中的(of)含量也會升高。但ctDNA出(out)現假陽性的(of)幾率更低，因爲(for)它是(yes)由具有癌細胞印記的(of)突變和(and)其他(he)遺傳變化定義的(of)。盡管大(big)多數蛋白質生(born)物标識能在(exist)血液中存在(exist)數周，而ctDNA的(of)半衰期不(No)到(arrive)兩個(indivual)小時(hour)，因此，後者呈現的(of)是(yes)腫瘤實時(hour)的(of)情況。劍橋團隊與約翰斯·霍普金斯團隊分别發現，在(exist)監測乳癌和(and)腸癌時(hour)，與蛋白質生(born)物标識相比，ctDNA更加敏感，并且在(exist)追蹤腫瘤消失、擴散和(and)複發時(hour)，ctDNA也更準确。另外，這(this)兩個(indivual)小組還發現，ctDNA比循環腫瘤細胞更敏感。在(exist)實驗中，Diaz研究小組發現，當兩者都存在(exist)時(hour)，ctDNA碎片在(exist)數量上(superior)要(want)超過循環腫瘤細胞（50：1）。在(exist)過去十年，高通量測序技術（又稱爲(for)二代測序技術）迅速發展，并成功應用(use)于(At)遺傳性疾病及腫瘤的(of)診斷。如能将高通量測序技術運用(use)在(exist)液态活檢上(superior)，将爲(for)分子診斷開拓一(one)個(indivual)更爲(for)廣闊的(of)天地(land)。高通量測序檢測ctDNA技術隻需要(want)少量的(of)外周血，就可以(by)檢測出(out)腫瘤DNA中的(of)突變。
由于(At)ctDNA的(of)二代測序檢測準确、靈敏、無創且高通量，目前已用(use)于(At)靶向治療的(of)實時(hour)監測。英國(country)癌症研究所Bono實驗室發表在(exist)《臨床癌症研究》（Clinical Cancer Research）上(superior)的(of)文章報道了(Got it)ctDNA的(of)二代測序檢測在(exist)監測靶向藥物療效中的(of)應用(use)。該研究來(Come)自一(one)個(indivual)針對PI3K-AKT-mTOR信号通路的(of)靶向藥物的(of)臨床實驗，共39位癌症患者參與此項研究，在(exist)服藥前已有不(No)同程度的(of)癌細胞轉移迹象。首先，該研究證明外周血ctDNA中檢測到(arrive)的(of)突變均在(exist)手術活檢樣品中出(out)現，說明ctDNA可以(by)反應腫瘤組織分子水平變化。
圖3. 循環腫瘤DNA (ctDNA)測序
接下來(Come)，在(exist)服用(use)靶向藥物過程中，每隔一(one)段時(hour)間收集外周血進行ctDNA測序，用(use)以(by)監控上(superior)述信号通路中的(of)熱點突變的(of)變化，從而爲(for)判斷藥物的(of)療效提供依據，結果顯示，ctDNA突變的(of)變化趨勢與傳統CT檢測到(arrive)的(of)腫瘤大(big)小變化基本一(one)緻，實現了(Got it)腫瘤分子水平監控。靶向藥物針對基因突變而設計，因此ctDNA中的(of)突變變化可以(by)更靈敏準确地(land)判斷靶向藥物的(of)療效。
（二）ctDNA研究進展
當前的(of)分子診斷技術主要(want)還是(yes)基于(At)細針穿刺，其面臨的(of)技術局限是(yes)靈敏度問題。由于(At)腫瘤的(of)異質性，細針穿刺所取到(arrive)的(of)少量樣本往往無法反映腫瘤突變的(of)全貌，也可能會遺漏惡性的(of)亞克隆。某些實體瘤如肺癌，穿刺取樣存在(exist)困難和(and)風險。所以(by)，采用(use)無創檢測手段對血液中的(of)ctDNA進行檢測和(and)測序，可以(by)幫助人(people)們(them)通過取血得到(arrive)更全面的(of)癌症信息，告訴醫生(born)治療是(yes)否已經起作(do)用(use)，腫瘤有沒有演化出(out)抗性2,3。研究發現，在(exist)前列腺癌、肺癌、乳腺癌、大(big)腸癌、肝癌、膀胱癌、宮頸癌、胰腺癌、卵巢癌等人(people)類惡性腫瘤中均能檢測到(arrive)ctDNA。目前針對ctDNA的(of)研究主要(want)包括以(by)下四個(indivual)方面：
1. 追蹤腫瘤進化
2015年發表于(At)《Nature Communications》雜志的(of)一(one)項新的(of)研究，科學家首次發現，流進入血液中的(of)腫瘤DNA，可用(use)于(At)實時(hour)跟蹤腫瘤的(of)發展以(by)及對治療的(of)響應4。劍橋大(big)學的(of)研究人(people)員從腫瘤已經擴散到(arrive)身體其他(he)部位的(of)一(one)名ER、HER-2陽性的(of)乳腺癌患者身上(superior)，在(exist)患者治療期間采集了(Got it)8份腫瘤樣本（圖4-1）和(and)9份血液樣本進行外顯子組和(and)靶向擴增子測序。他(he)們(them)仔細研究了(Got it)進入血液中的(of)、來(Come)自死亡腫瘤細胞的(of)小DNA片段，并将它們(them)與在(exist)同一(one)時(hour)間點上(superior)采集的(of)活組織切片進行比較。
圖4-1. 采集腫瘤樣本（活檢部位）
結果表明，血液樣本中的(of)ctDNA與活檢相匹配，反映了(Got it)當腫瘤發展和(and)響應治療時(hour)出(out)現了(Got it)相同的(of)模式和(and)遺傳變化時(hour)機。這(this)些結果提供了(Got it)第一(one)個(indivual)原理證明，分析了(Got it)血液中的(of)ctDNA，可以(by)準确地(land)監測體内的(of)癌症。使用(use)PyClone的(of)貝葉斯聚類分析發現8個(indivual)主要(want)的(of)突變簇，并繪制出(out)腫瘤進化的(of)系統樹（圖4-2）。
圖4-2. 腫瘤進化樹
本次研究的(of)結果預示：在(exist)利用(use)ctDNA實時(hour)監控腫瘤負荷方面，具有在(exist)血漿中豐度最高，在(exist)随訪過程中不(No)易丢失等優勢的(of)軀幹突變基因（truncal mutations）将是(yes)最好的(of)候選靶标。同時(hour)，藥物治療前血漿中的(of)耐藥相關的(of)ctDNA突變可能爲(for)治療方案的(of)選擇提供依據。
2. 耐藥機制研究
腫瘤的(of)靶向治療顯著提升了(Got it)患者的(of)臨床治療效果，然而不(No)幸的(of)是(yes)大(big)部分患者都會産生(born)獲得性治療抵抗。阻礙臨床患者治療的(of)一(one)大(big)主要(want)問題是(yes)對于(At)耐藥機制的(of)理解5,6。2016年發表的(of)兩項研究顯示血漿遊離DNA分析能夠成功檢測出(out)非小細胞肺癌和(and)結直腸癌種EGFR靶向治療的(of)異質性耐藥機制5。
圖5. 患者血漿遊離DNA采集
本研究通過對EGFR TKI AZD9291耐藥的(of)肺癌的(of)無細胞血清DNA (cfDNA)的(of)研究，利用(use)高通量測序技術（next generation sequencing, NGS），發現在(exist)7個(indivual)病人(people)中有一(one)個(indivual)有EGFR C797S突變把這(this)種突變加入肺癌細胞系中，能導緻肺癌細胞對AZD9291産生(born)耐藥。随後進行了(Got it)微滴式數字PCR (ddPCR)，對15個(indivual)經過AZD9291治療的(of)病人(people)的(of)無細胞血清DNA (cfDNA)進行了(Got it)檢測，發現他(he)們(them)在(exist)治療之前全都有T790M突變，但是(yes)接受AZD9291治療并耐藥後，6個(indivual)病人(people)産生(born)了(Got it)EGFR C797S突變，5個(indivual)病人(people)保持了(Got it)T790M突變但是(yes)沒有C797S突變，4個(indivual)病人(people)失去了(Got it)T790M突變，但是(yes)依然有EGFR通路的(of)激活7。該研究表明，在(exist)治療初期的(of)克隆會随着時(hour)間波動，無細胞血清DNA (cfDNA)監測有助于(At)腫瘤負荷的(of)檢測以(by)及治療反應的(of)判斷。
3. 預後評估
2013年發表于(At)《新英格蘭雜志》一(one)篇研究報道：在(exist)對30名轉移性乳腺癌腫瘤患者檢測中，97%可成功檢出(out)ctDNA；78%可檢出(out)CA 15-3，87%可檢出(out)循環腫瘤細胞8-10。ctDNA水平顯示出(out)動态範圍以(by)及與腫瘤負荷的(of)關聯性均大(big)于(At)CA 15-3或循環腫瘤細胞(CTC)。ctDNA爲(for)53%的(of)患者提供了(Got it)最早的(of)治療反應監測指标。該研究表明，ctDNA攜帶腫瘤特異性變異，與現有FDA批準的(of)生(born)物标記物和(and)CTC相比，能更有效監測轉移性乳腺癌。
4. 藥物療效反應
2014年發表于(At)《Sci Transl Med 》上(superior)的(of)一(one)篇研究報道：對轉移性結直腸癌患者治療前後血液樣本中血漿遊離循環腫瘤DNA分别進行全基因組、全外顯子組或者目标區域高通量測序，能夠發現患者體内治療前後的(of)不(No)同的(of)基因發生(born)了(Got it)一(one)種或多種突變，這(this)些新出(out)現的(of)突變可能是(yes)導緻藥物耐藥的(of)原因之一(one)11。當患者樣本量積累到(arrive)足夠大(big)時(hour)，可以(by)有助于(At)鑒定腫瘤耐藥或複發相關的(of)基因或通路。
圖6. ctDNA水平與療效監控及預後評估
（三）ctDNA檢測平台
過去10年間科學家發展出(out)了(Got it)更靈敏的(of)技術，能在(exist)片刻間探測和(and)量化DNA數量。例如，即使ctDNA與健康細胞DNA的(of)比例爲(for)1/10000，一(one)個(indivual)名爲(for)BEAMing的(of)技術也能将其檢測出(out)來(Come)。該技術由約翰斯·霍普金斯大(big)學遺傳腫瘤學家Bert Vogelstein和(and)Kenneth Kinzler所開發。2007年，他(he)們(them)利用(use)該技術追蹤了(Got it)18位接受治療的(of)腸癌患者。手術後，患者ctDNA水平下降了(Got it)99%，但在(exist)許多病例中，該信号沒有完全消失。首次術後訪問發現，ctDNA的(of)患者除一(one)人(people)外都出(out)現腫瘤複發。而術後無法探測到(arrive)ctDNA水平的(of)患者沒有出(out)現複發。
如何才能夠快速、準确地(land)對ctDNA進行檢測呢？對于(At)DNA的(of)檢測，當然首推測序技術，無論是(yes)成就了(Got it)人(people)類基因組計劃的(of)雙脫氧法一(one)代測序技術，還是(yes)現在(exist)方興未艾的(of)二代測序技術，以(by)及如雨後春筍般遍地(land)開花的(of)三代測序技術，他(he)們(them)的(of)測試對象都是(yes)DNA。但考慮到(arrive)ctDNA的(of)片段長度大(big)小一(one)般都介于(At)160-500bp範圍内，而且含量極低，因此要(want)采用(use)高通量的(of)測序技術來(Come)對如此低豐度的(of)待測産物進行研究，也許并不(No)一(one)定是(yes)最佳的(of)選擇。而通過将待測樣本轉換成高速運動的(of)離子，根據不(No)同離子擁有不(No)同的(of)質荷比(m/z)，來(Come)對待測樣本進行分離和(and)檢測的(of)質譜（Mass Spectrometry, MS）技術，則在(exist)這(this)一(one)領域具有廣泛的(of)優勢。
1. 分離富集
ctDNA由于(At)片段較小、含量很少．而且容易和(and)血漿蛋白相結合，因而常規的(of)提取效率都不(No)高。針對血漿中ctDNA的(of)抽提原理主要(want)有四大(big)類：鹽析法、酚．氯仿抽提法、微柱吸附法和(and)磁珠吸附法。目前商品化的(of)試劑盒絕大(big)多數都是(yes)基于(At)以(by)上(superior)後兩種原理研發的(of)。通過比較各類試劑盒發現，磁珠法獲得的(of)ctDNA在(exist)質量和(and)含量上(superior)都要(want)優于(At)微柱吸附法，假陽性率也較低。tDNA研究的(of)關鍵技術是(yes)如何從外周血中分離得到(arrive)足夠量的(of)、高質量的(of)遊離DNA，相對而言該檢測技術比較簡單。ctDNA檢測技術根據檢測目的(of)來(Come)選擇相應的(of)技術方法。其中大(big)部分是(yes)以(by)PCR技術爲(for)基礎，如實時(hour)熒光定量PCR、甲基化特異性PCR等，也有基于(At)微珠富集原理的(of)方法。目前，ctDNA檢測技術已經廣泛地(land)應用(use)于(At)腫瘤靶向治療、診斷及預後相關标記的(of)檢測。尤其是(yes)新一(one)代測序技術飛速發展的(of)今天。基于(At)ctDNA的(of)全基因組測序、全外顯子測序或全轉錄本深度測序方法将逐漸替代原來(Come)傳統的(of)基因突變或測序方法。
2. 檢測技術
2.1數字PCR
數字PCR在(exist)如下方面優勢突出(out)：操作(do)快速、簡便（測序前無需對來(Come)源于(At)CTC的(of)DNA進行預擴增）；無需複雜的(of)生(born)物信息學分析；檢測靈敏度高等。在(exist)ctDNA的(of)檢測方面，NGS和(and)ddPCR的(of)聯合使用(use)是(yes)大(big)勢所趨。國(country)際肺癌研究學會（IASLC）主席Tony Mok（莫樹錦）會議期間提及的(of)肺癌相關基因突變檢測的(of)方案中就體現了(Got it)這(this)一(one)趨勢。但是(yes)值得注意的(of)是(yes)，數字PCR技術隻能針對已知突變進行檢測，無法像測序技術一(one)樣讀出(out)核酸序列或者檢測出(out)未知突變。
2.2高通量測序
Illumina Hiseq測序是(yes)一(one)種基于(At)單分子簇的(of)邊合成邊測序技術，該檢測平台在(exist)單次運行中實現大(big)量基因組、外顯子組的(of)測序，讓大(big)型研究能在(exist)最少的(of)運行中完成。測序時(hour)将基因組DNA的(of)随機片段附着到(arrive)光學透明的(of)玻璃表面（即Flowcell），這(this)些DNA片段經過延伸和(and)橋式擴增後，在(exist)Flowcell上(superior)形成了(Got it)數以(by)億計Cluster，每個(indivual)Cluster是(yes)具有數千份相同模闆的(of)單分子簇。然後利用(use)帶熒光基團的(of)四種特殊脫氧核糖核酸，通過可逆性終止的(of)SBS（邊合成邊測序）技術對待測的(of)模闆DNA進行測序12。
圖7. Illumina Hiseq高通量測序示意圖
采用(use)芯片捕獲的(of)方法捕獲基因的(of)全外顯子序列，然後進行高通量深度測序。通過測序數據分析獲得基因變異數據，将所得變異信息與數據庫進行對比，判斷變異所屬種類，出(out)具結果報告。
2.3質譜法
質譜儀，根據其部件功能通常可分爲(for)5個(indivual)部分，①進樣系統，②離子源，③質量分析器，④檢測器和(and)⑤數據處理系統。對以(by)核酸、蛋白爲(for)待測産物的(of)質譜儀而言，其離子源一(one)般需要(want)采用(use)較爲(for)溫和(and)的(of)電離方式，比如電噴霧電離（Electrospray Ionization，ESI），基質輔助激光解吸電離（Mass-Assisted Laser Desorption/Ionization，MALDI）等類型13-15。
采用(use)MALDI TOF質譜對ctDNA進行檢測的(of)最大(big)優勢在(exist)于(At)準确度高、重複性好、穩定性強、檢測速度快、樣本處理标準化。其可用(use)于(At)ctDNA的(of)基因型分析（genotyping），基因突變檢測（mutation detection），DNA甲基化（DNA methylation），基因表達（gene expression），拷貝數差異（copy number variation，CNV），單倍體序列差異（haploid sequence variation，HSV）等多項檢測與分析16。
所述檢測已在(exist)美國(country)麻省大(big)學伍斯特分子診斷實驗室（University of Massachusetts, Worcester Molecular Diagnostics Laboratory），梅奧醫學中心（MayoClinic CLIA Lab）等世界知名科研機構與臨床醫院得到(arrive)廣泛認可與應用(use)，并獲得美國(country)FDA批準用(use)于(At)臨床檢測。
（四）ctDNA研究策略簡介
在(exist)實體瘤患者治療前、治療後與随訪期間按照不(No)同時(hour)間點多次采集外周血樣本，分别對血漿ctDNA進行ddPCR檢測或者全外顯子組、目标區域高通量測序。不(No)同時(hour)期的(of)外周血樣本基因突變類型與基因突變頻率可以(by)反映患者在(exist)治療期間的(of)病情進展、對藥物療效的(of)反應以(by)及可能的(of)預後信息。當患者樣本量積累到(arrive)足夠大(big)時(hour)，可以(by)有助于(At)鑒定腫瘤耐藥或複發相關的(of)基因或通路。
圖8. ctDNA研究策略
（五）總結與展望
生(born)物标志物的(of)發現是(yes)一(one)個(indivual)不(No)斷發展的(of)領域，分析和(and)診斷的(of)敏感性需得到(arrive)進一(one)步提高，以(by)便分析ctDNA的(of)特定突變基因。此外關于(At)腫瘤的(of)異質性方面即檢測出(out)的(of)血漿ctDNA可反映全部的(of)不(No)同轉移部位腫瘤的(of)突變情況還是(yes)僅代表影響疾病進展和(and)治療抵抗的(of)最重要(want)的(of)DNA突變則有待更深入地(land)研究17。随着技術的(of)進步和(and)成本的(of)降低，全基因組測序可能成爲(for)檢驗醫學的(of)常規工具。同時(hour)分析血漿DNA 的(of)一(one)系列過程則需進行标準化，并提高檢測方法的(of)敏感性18。
如今ctDNA技術尚未運用(use)于(At)臨床實踐，許多機制尚不(No)十分清楚11。目前臨床尚未開展多中心、大(big)樣本的(of)基礎以(by)及臨床研究，缺乏有價值的(of)科研資料來(Come)指導臨床，但随着廣大(big)科研工作(do)人(people)員對 ctDNA的(of)不(No)斷探索和(and)研究，ctDNA 将可能成爲(for)臨床腫瘤學中一(one)種具有重要(want)意義的(of)生(born)物标志物。綜上(superior)所述，ctDNA 技術作(do)爲(for)一(one)種方便、非侵入性、可重複性和(and)高敏感性的(of)“液态活檢”技術，能夠了(Got it)解循環中腫瘤特異性突變，在(exist)腫瘤的(of)早期診斷、療效評估、複發和(and)預後判斷等方面發揮着重要(want)的(of)作(do)用(use)。以(by)形态病理學爲(for)基礎，以(by)分子病理學爲(for)輔助。兩者相輔相成，液态活檢将爲(for)人(people)類更深入地(land)了(Got it)解疾病的(of)本質提供更豐富的(of)、可靠的(of)手段5。
在(exist)未來(Come)，ctDNA結合ddPCR技術或者新一(one)代測序技術将有望實現：
1.早期篩查：在(exist)影像學未發現病竈時(hour)對被檢測者進行早期篩查，判斷腫瘤原發竈；
2.實時(hour)監控：ctDNA檢測作(do)爲(for)一(one)種無創的(of)檢測方法，能夠真實的(of)反映實體瘤組織中的(of)基因突變圖譜與頻率，并且能夠進一(one)步爲(for)患者提供最早的(of)實時(hour)監控檢測指标；
3.治療反應：在(exist)治療前後分别檢測患者的(of)ctDNA，可以(by)及時(hour)檢測患者體内的(of)實體瘤相關基因的(of)突變圖譜及頻率，監測患者的(of)腫瘤負荷及對治療的(of)敏感性與耐藥性；
4.判斷預後：在(exist)治療前或治療後，對患者體内實體瘤相關基因進行監測，可以(by)評估腫瘤特異性變異的(of)突變頻率，對醫生(born)判斷患者的(of)預後起到(arrive)指導作(do)用(use)。
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二、液态活檢之循環腫瘤細胞（CTC）研究進展及技術平台簡介
（一(one)）CTC基礎知識
1. CTC的(of)基本概念
1869年，澳大(big)利亞學者Ashworth在(exist)一(one)例轉移性腫瘤患者血液中首次觀察到(arrive)從實體腫瘤中脫離并進入血液循環的(of)腫瘤細胞，并首次提出(out)了(Got it)循環腫瘤細胞（CTC）的(of)概念1。1976年，Nowell将CTC的(of)定義修正爲(for)：來(Come)源于(At)原發腫瘤或轉移腫瘤，獲得脫離基底膜的(of)能力并入侵通過組織基質進入血管的(of)腫瘤細胞。上(superior)世紀90年代，科學家開始對CTC的(of)臨床意義進行研究。2000後，CTC日益成爲(for)臨床上(superior)液态活檢标志物的(of)研究熱點，并在(exist)臨床越來(Come)越廣泛的(of)應用(use)3,4。
2. CTC的(of)特點3-5
2.1 可能是(yes)單個(indivual)細胞從病竈脫落進入外周血，也可能是(yes)成簇脫落；
2.2 不(No)同CTC在(exist)形态上(superior)有較大(big)差别；
2.3 CTC有很強的(of)異質性，不(No)同類型的(of)腫瘤CTC差别很大(big)，即使同一(one)病人(people)來(Come)源的(of)不(No)同CTC細胞表所表達的(of)标志物種類及表達量也有差異；
2.4 CTC可能在(exist)循環過程中發生(born)上(superior)皮間質轉化（EMT）逐漸喪失上(superior)皮标志物；
2.5血液中存在(exist)可檢測CTC的(of)患者比例随癌症類型的(of)不(No)同而不(No)同。比如結直腸癌、卵巢癌和(and)乳腺癌大(big)約是(yes)50-70%，而非小細胞肺癌則低至30%；
2.6 CTC活力強，有抗脫巢凋亡活性；
2.7 CTC有侵襲和(and)轉移潛能。
圖1. CTC的(of)特點
（二）CTC檢測技術
血液中大(big)部分成分是(yes)白細胞和(and)紅細胞，CTC所占的(of)比例相對較少。每10mL血液中，含有1億個(indivual)白細胞和(and)500億個(indivual)左右紅細胞，而CTC的(of)數目可能僅有幾個(indivual)到(arrive)幾十個(indivual)。想要(want)準确地(land)檢測CTC細胞數目依賴非常靈敏的(of)檢測手段。近年來(Come)随着現代醫學研究技術的(of)進步和(and)CTC臨床應用(use)價值凸顯，許多研究機構和(and)研發團隊都在(exist)推出(out)不(No)同的(of)CTC檢測技術。CTC檢測技術包括CTC的(of)富集（分離）和(and)CTC的(of)分析鑒定（識别）等5。
1、CTC富集（分離）
1.1 免疫親和(and)法
建立在(exist)免疫親和(and)原理上(superior)的(of)CTC富集方法，利用(use)特異性抗體與細胞表面抗原進行特異性結合來(Come)富集CTC。基于(At)免疫親和(and)的(of)方法也分爲(for)很多種5：
1.1.1免疫磁珠法：以(by)CellSearch®法爲(for)代表，在(exist)磁珠上(superior)包被細胞表面粘附分子EpCAM，來(Come)捕獲CTC。臨床研究證明該方法檢測出(out)的(of)CTC數目與腫瘤的(of)預後密切相關。FDA已批準CellSearch®檢測的(of)CTC數目用(use)于(At)預測轉移性乳腺癌，前列腺癌，結直腸癌的(of)預後。
1.1.2微流體法：Nagrath和(and)Toner的(of)團隊研發了(Got it)一(one)種用(use)于(At)捕獲CTC的(of)微流體。上(superior)面有78，000個(indivual)微柱與EpCAM的(of)抗體相結合，可直接捕獲全血中的(of)CTC。整個(indivual)微流體共有970 mm2的(of)表面積，在(exist)2mL/hour的(of)通量下，CTC捕獲效率>60%，特異性在(exist)50%左右。在(exist)多種轉移腫瘤中該方法已被證明有較高的(of)CTC捕獲效率。
1.1.3納米結構基體：Wang et al等人(people)将EpCAM抗體結合在(exist)矽質的(of)納米基體上(superior)，進行CTC捕獲。1mL/hour的(of)通量下，可以(by)達到(arrive)95%以(by)上(superior)的(of)捕獲效率。一(one)項研究利用(use)該方法對26例前列腺癌進行檢測，CTC的(of)檢出(out)率爲(for)20/26，明顯高于(At)CellSearch®系統（8/26）。
1.1.4微量離心管：由Hughes et al研制，在(exist)微量離心管上(superior)包被EpCAM及PSMA的(of)抗體，4.8mL/hour的(of)通量下，捕獲率可達50%，特異性達66%。用(use)該方法對14例轉移性腫瘤患者進行CTC檢測，檢出(out)率爲(for)100%，明顯高于(At)CellSearch®系統（9/14）。
1.1.5體内富集：将結合EpCAM的(of)裝置從前臂靜脈插入病人(people)體内，并停留30min，從而進行體内CTC富集。臨床實驗證明這(this)種方法對乳腺癌和(and)肺癌的(of)CTC細胞均有較高的(of)捕獲效率。
1.1.6白細胞去除法：屬于(At)陰性富集法。用(use)特異性抗體CD45，CD14等與白細胞結合，從而去除全血中的(of)白細胞。該方法比其它富集方法捕獲效率更高，但特異性明顯低于(At)其它方法。
利用(use)抗原抗體相互作(do)用(use)原理的(of)CTC富集方法可得到(arrive)較高的(of)純度。但捕獲效率對細胞表面抗原的(of)表達情況依賴較明顯。對于(At)依賴EpCAM的(of)捕獲方法，CTC捕獲效率與細胞表皮抗原的(of)表達情況密切相關，一(one)些CTC可能由于(At)EMT過程中表皮抗原發生(born)變化而未被捕獲。另外EpCAM法僅限于(At)對上(superior)皮來(Come)源的(of)CTC進行檢測。相對于(At)其它方法，免疫親和(and)法對CTC的(of)富集效率偏低。
1.2 物理特性富集法
依據CTC的(of)物理特性，如密度、大(big)小、可變形性及表面電荷等進行富集。
