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腫瘤外泌體研究進展及技術平台簡介
一(one)、Exosome簡介
2013年，美國(country)、德國(country)3位科學家憑借他(he)們(them)所發現的(of)細胞囊泡運輸的(of)調節機制，榮獲2013年諾貝爾生(born)理學或醫學獎。而外泌體作(do)爲(for)細胞囊泡運輸中非常重要(want)的(of)組成部分受到(arrive)越來(Come)越多的(of)關注，相信日後将會有更多外泌體相關機制和(and)功能被發現、研究策略也将不(No)斷豐富與完善。
外泌體（exosome）是(yes)由細胞内多泡體與細胞膜融合後，釋放到(arrive)細胞外基質中的(of)一(one)種直徑約30~120nm的(of)膜性囊泡。最早由Johnstone等研究者在(exist)研究網織紅細胞向成熟紅細胞轉變過程時(hour)發現[1]。又經過多年研究，科學家發現exosome的(of)來(Come)源廣泛，除了(Got it)網織紅細胞以(by)外，T細胞、B細胞、血小闆、樹突狀細胞、肥大(big)細胞等血細胞及上(superior)皮細胞、腫瘤細胞等其他(he)非血源性細胞都會分泌exosome，被分泌出(out)的(of)exosome會進入各種體液如羊水，腹水，鼻灌洗液，唾液，血清，血漿，乳汁，尿液，腦脊髓液等中，通過循環系統到(arrive)達其他(he)細胞與組織，産生(born)遠程調控作(do)用(use)[2]。
（一(one)）Exosome的(of)形成
與細胞代謝過程中産生(born)的(of)其他(he)膜性小囊泡不(No)同，exosome是(yes)經由内體途徑生(born)成（圖1）。細胞内晚期内體的(of)界膜多處凹陷，向内出(out)芽形成管腔狀囊泡，從而轉變爲(for)具有動态亞細胞結構的(of)多囊體(multi-vesicle bodys，MVBs)。當MVBs與溶酶體融合後，其内的(of)管腔狀囊泡發生(born)降解；而與胞膜融合後，其内的(of)管腔狀囊泡再次凹陷以(by)内出(out)芽方式形成顆粒狀小囊泡，并釋放入細胞外環境，即exosome[3]。Exosome的(of)生(born)成是(yes)一(one)個(indivual)連續性的(of)過程，某些類型的(of)細胞如血小闆經活化刺激後可增加exosome的(of)釋放，其他(he)因素如自由基壓力、UV放射、膜膽固醇含量降低及胞内鈣離子水平升高等也能增加exosome的(of)含量。經過兩次内出(out)芽，内體中各種物質被分選後載入exosome。不(No)同細胞來(Come)源exosome表面攜帶有相似的(of)保守蛋白，如CD9、CD63、CD81、Alix、Tsg101等，其内則分别含有與其來(Come)源細胞相關的(of)特異性生(born)物學物質。這(this)些物質不(No)僅能反映其來(Come)源細胞的(of)類型(如成熟網織紅細胞來(Come)源Exosome含有大(big)量轉鐵蛋白受體，而淋巴細胞或樹突狀細胞來(Come)源exosome中則含量較少)，更重要(want)的(of)是(yes)還與其來(Come)源細胞的(of)生(born)理功能或病理改變密切相關（如腫瘤細胞來(Come)源的(of)exosome既含有腫瘤抗原又含有腫瘤特異性miRNA)。
圖1.Exosome的(of)形成（Raposo et al. J Cell Biol. 2013, 200: 373-383）
（二）Exosome的(of)組成
Exosome内含物的(of)很大(big)部分是(yes)蛋白質，大(big)緻可分爲(for)兩類：一(one)類是(yes)分布于(At)exosome的(of)表面或内腔中參與exosome結構形成的(of)蛋白質，如肌動蛋白、微管蛋白和(and)微絲結合蛋白等細胞骨架成分；膜轉運和(and)融合相關蛋白，如：Annexins、Alix、Flotillin、多種Rab蛋白和(and)Tsg101等；另外一(one)些信号分子如蛋白激酶、G-蛋白等；還有大(big)量與exosome生(born)成密切相關的(of)四跨膜區蛋白質超家族成員，如CD9、CD63、CD81和(and)CD82等。許多exosome中還存在(exist)抗原呈遞分子MHC-I與Hsp70或Hsp90等分子。另一(one)大(big)類蛋白質則與細胞來(Come)源有關，有些exosome中甚至含有其來(Come)源細胞中的(of)大(big)部分蛋白質種類。例如：抗原呈遞細胞來(Come)源的(of)exosome中含有豐富的(of)MHC-I和(and)MHC-II、CD80和(and)CD86；血小闆來(Come)源的(of)exosome中含有血友病因子和(and)整合蛋白CD41a；而T淋巴細胞分泌的(of)Exosome表面帶有穿孔蛋白和(and)顆粒酶。腫瘤細胞産生(born)的(of)exosome中還可以(by)檢測到(arrive)過度表達的(of)蛋白質标志物，如FasL、TRAIL和(and)TGF-β等腫瘤抗原和(and)免疫抑制蛋白，這(this)使得exosome在(exist)腫瘤及相關疾病的(of)診斷中具有重要(want)的(of)潛在(exist)應用(use)價值。
圖2. Exosome的(of)組成（Zhang et al. Journal of Hematology & Oncology,2015, 8:83）
除蛋白質外，exosome中還含有大(big)量的(of)mRNA和(and)miRNA。Exosome不(No)僅保護體外RNA穩定存在(exist)，還能夠作(do)爲(for)載體将RNA轉運到(arrive)特定的(of)靶細胞中，發揮重要(want)調控作(do)用(use)。從人(people)乳汁中提取的(of)exosome中含有60餘種與免疫調節相關的(of)miRNA；膠質瘤細胞的(of)exosome中則含有大(big)量與細胞增殖遷移、血管形成和(and)免疫反應相關的(of)mRNA；腫瘤來(Come)源的(of)exosome中miRNA的(of)存在(exist)極爲(for)普遍并且豐度較高，在(exist)腫瘤自身的(of)調控中發揮重要(want)作(do)用(use)，已成爲(for)目前的(of)研究熱點。研究發現，RNA含量豐富的(of)exosome，主要(want)參與組織間遺傳信息的(of)傳遞過程；RNA含量低的(of)exosome，如免疫細胞來(Come)源的(of)exosome，主要(want)在(exist)抗原遞呈和(and)免疫共刺激過程中發揮作(do)用(use)。
Exosome中的(of)脂類分子主要(want)是(yes)細胞質膜及其類似成分，另有一(one)些與來(Come)源細胞相關的(of)特殊脂類。這(this)些脂類分子不(No)僅參與維持exosome的(of)形态，還可作(do)爲(for)信号分子參與許多生(born)物學過程，如對Notch等一(one)些關鍵腫瘤生(born)存信号通路的(of)抑制，引起細胞凋亡，以(by)及對前列腺素、磷酸激酶A2、C和(and)D等一(one)些中間信号分子的(of)傳遞，參與細胞間通訊。
随着蛋白質組學研究和(and)基因測序技術的(of)快速發展，已經證明exosome複雜的(of)結構，并且已經發展出(out)一(one)個(indivual)數據庫（http://microvesicles.org; http://exocarta.org）用(use)于(At)描述囊泡内容物的(of)具體成分。據檢測結果，細胞外囊泡可以(by)攜帶92,897種蛋白質，584種脂類分子，4,934 種miRNAs及27,642種mRNAs。腫瘤患者和(and)自身免疫性疾病患者exosome的(of)含量比正常人(people)要(want)高，這(this)表明其在(exist)各種疾病中的(of)重要(want)作(do)用(use)，然而，參與疾病進展的(of)具體exosome内容物與具體機制仍然是(yes)一(one)個(indivual)挑戰。許多數據表明在(exist)不(No)同的(of)理化狀态下（電離輻射、發熱、低pH狀态、高血鈣、氧化應激、缺氧)，相同細胞系所分泌的(of)囊泡的(of)數量和(and)内容物可以(by)完全不(No)同。這(this)意味着細胞通過釋放exosome進行通訊以(by)及在(exist)不(No)利條件情況下的(of)調節作(do)用(use)。由于(At)exosome的(of)特殊組成，能夠廣泛參與到(arrive)細胞通訊過程中，因此具有很好的(of)藥物釋放系統開發潛力。
研究發現，抗原提呈細胞（APC）分泌的(of)exosome可以(by)刺激T細胞的(of)體外增殖和(and)誘導體内的(of)抗腫瘤免疫反應。從腫瘤細胞中分泌出(out)的(of)包含腫瘤抗原的(of)exosome則可以(by)通過APC交叉呈遞給細胞毒性T淋巴細胞（CTL），使其産生(born)腫瘤殺傷作(do)用(use)。因此，exosome作(do)爲(for)一(one)種潛力巨大(big)的(of)腫瘤疫苗，得到(arrive)了(Got it)廣泛的(of)研究。然而，有學者發現腫瘤細胞來(Come)源的(of)exosome對腫瘤生(born)長具有促進作(do)用(use)。一(one)項研究報道，給予預先種植卵巢癌細胞的(of)小鼠腹腔注射從卵巢癌患者腹腔積液中分離出(out)的(of)exosome，可以(by)明顯促進小鼠腹腔内腫瘤的(of)生(born)長。從小鼠皮下腫瘤實體中分離出(out)exosome，證實其具有促進腫瘤生(born)長的(of)作(do)用(use)。目前，已有越來(Come)越多的(of)學者開始關注exosome在(exist)腫瘤發生(born)和(and)發展中的(of)作(do)用(use)及其機制。
二、Exosome研究意義
Exosome在(exist)腫瘤的(of)發病機制、診斷及治療等領域發揮重要(want)作(do)用(use)：
圖3. Exosome在(exist)腫瘤中的(of)作(do)用(use)（Zhang et al. Journal of Hematology & Oncology,2015, 8:83）
（一(one)）Exosome參與腫瘤發生(born)與發展
1、Exosome介導腫瘤細胞增生(born)和(and)幹性形成
腫瘤細胞通過與自身微環境的(of)信息交流促進腫瘤細胞的(of)增殖和(and)侵襲，而exosome可以(by)充當這(this)種信息載體。當細胞中出(out)現基因突變時(hour)，exosome會通過膜融合把這(this)種突變信息傳遞至其它正常細胞，從而導緻原癌基因的(of)激活、抗凋亡基因的(of)表達及錨定非依賴性生(born)長能力的(of)增加，使腫瘤細胞獲得增生(born)的(of)特性。腫瘤細胞來(Come)源的(of)exosome（tumor-derived exosomes，TDEs）通過直接抑制免疫細胞，或調節相關細胞因子的(of)表達等途徑，促進腫瘤細胞的(of)免疫逃逸，爲(for)腫瘤細胞在(exist)體内生(born)長創造條件。Exosome從腫瘤細胞分泌後，在(exist)新的(of)環境中通過分泌蛋白質調節腫瘤轉移前的(of)微環境，而這(this)一(one)微環境的(of)改變将明顯影響腫瘤細胞的(of)幹性。一(one)系列研究表明，exosome能夠反映腫瘤細胞的(of)缺氧狀态，缺氧的(of)微環境可維持腫瘤細胞的(of)自我(I)更新和(and)多向分化潛能，exosome可以(by)通過上(superior)調Notch、Wnt等多種信号通路影響腫瘤細胞的(of)幹性。
2、Exosome介導腫瘤免疫耐受
腫瘤細胞來(Come)源的(of)exosome（TDEs）可作(do)爲(for)腫瘤抗原，同時(hour)也能将腫瘤抗原呈遞至抗原遞呈細胞，引起抗腫瘤免疫應答反應，因此，TDEs既是(yes)一(one)種抗原呈遞系統，同時(hour)也是(yes)腫瘤排斥抗原的(of)來(Come)源。TDEs也能傳遞某些抑制信号，在(exist)機體免疫應答過程中起負性調節作(do)用(use)，誘導腫瘤細胞形成免疫耐受。免疫耐受是(yes)腫瘤細胞逃避免疫監視的(of)主要(want)原因，exosome介導的(of)免疫耐受與其含有的(of)腫瘤相關抗原和(and)免疫抑制分子相關，這(this)些免疫分子能夠下調免疫系統的(of)表達。有研究表明，TDEs誘導的(of)免疫耐受與其表面FasL相關聯，Fas存在(exist)于(At)多種細胞表面，當機體受到(arrive)外界刺激後，Fas含量迅速上(superior)升，并通過Fas/FasL途徑誘導細胞死亡，以(by)此來(Come)調節免疫應答以(by)及維持免疫耐受。
3、Exosome介導腫瘤免疫逃逸
髓源性抑制細胞（Myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）是(yes)骨髓來(Come)源的(of)一(one)群異質性細胞，是(yes)樹突狀細胞（DCs）、巨噬細胞和(and)（或）粒細胞的(of)前體，具有顯著抑制免疫應答的(of)能力。在(exist)荷瘤小鼠和(and)腫瘤患者體内這(this)類細胞增多，并促進了(Got it)腫瘤的(of)生(born)長。來(Come)自法國(country)國(country)家健康與醫學研究院的(of)研究人(people)員們(them)從小鼠細胞系培養上(superior)清中分離出(out)腫瘤來(Come)源的(of)exosomes（TDEs），并發現exosome上(superior)的(of)HSP72通過激活STAT3抑制了(Got it)MDSCs的(of)免疫抑制作(do)用(use)。另外，腫瘤來(Come)源的(of)可溶性分子通過Erk激發了(Got it)MDSCs的(of)擴增。Exosome的(of)HSP72通過TLR2/MyD88依賴的(of)方式誘導IL-6的(of)自分泌，從而激活STAT3。更重要(want)的(of)是(yes)，在(exist)3個(indivual)不(No)同的(of)小鼠腫瘤模型中使用(use)dimethylamilorid（二甲基阿米洛利）抑制exosome的(of)分泌可增強化療藥物cyclophosphamide（環磷酰胺）的(of)抗腫瘤效果。人(people)腫瘤細胞系來(Come)源的(of)exosome可激活MDSCs，從而激發其Hsp72/TLR2依賴的(of)免疫抑制作(do)用(use)。用(use)amiloride（阿米洛利，一(one)種高血壓治療藥物，也可抑制Exosome的(of)形成）處理腫瘤病人(people)來(Come)源的(of)MDSCs可降低其免疫抑制作(do)用(use)。該工作(do)發現TDEs含有膜蛋白HSP72，促進MDSCs的(of)免疫抑制功能，抑制了(Got it)腫瘤的(of)免疫監督，從而介導了(Got it)腫瘤的(of)免疫逃逸[4]。
4、Exosome介導腫瘤耐藥
多藥耐藥是(yes)指腫瘤細胞通過各種機制進行抵抗細胞抑制藥物和(and)細胞毒性藥物的(of)作(do)用(use)。主要(want)由細胞膜蛋白ATP-binding cassettes（ABCs）将毒性物質排出(out)胞外。另一(one)個(indivual)機制是(yes)細胞色素P450的(of)變異活性（由CYP基因家族的(of)遺傳性變異造成的(of)），這(this)使得細胞能夠更快地(land)代謝藥物。此外，腫瘤已經發展出(out)各種有效的(of)系統用(use)于(At)DNA損傷修複。研究表明exosome對腫瘤細胞對細胞抑制藥物的(of)無反應性起到(arrive)至關重要(want)的(of)作(do)用(use)，這(this)一(one)假說是(yes)在(exist)順鉑與耐藥性卵巢瘤中得到(arrive)證實的(of)，實驗中用(use)藥越多，exosome釋放量越大(big)，并且，exosome是(yes)藥物流出(out)胞内的(of)一(one)種途徑。順鉑治療後各種轉運蛋白表達量也顯著增多。此外在(exist)乳腺癌細胞、肺癌細胞等的(of)實驗中也表明這(this)一(one)現象。腫瘤内部存在(exist)異質性群體細胞，有些對藥物敏感，有些則耐藥，有實驗表明不(No)同亞群細胞之間通過exosome（可能的(of)miRNA: miR-100, miR-222,miR-30a, miR-17）傳遞而獲得耐藥性[5,6]。
（二）Exosome與腫瘤的(of)早期診斷
腫瘤在(exist)生(born)長過程中會不(No)斷地(land)将exosome釋放到(arrive)周圍環境中去，同時(hour)，exosome能在(exist)4℃保存96h，或是(yes)在(exist)-70℃下保存更長時(hour)間[7]，exosome幾乎在(exist)所有類型的(of)體液中均可有效檢測，且腫瘤exosome的(of)分子特征部分反映其來(Come)源腫瘤的(of)表型；所攜帶的(of)腫瘤特異性抗原和(and)miRNA可以(by)作(do)爲(for)腫瘤診斷标志物。在(exist)包括膀胱癌、腦瘤、結直腸癌和(and)黑色素瘤在(exist)内的(of)多種腫瘤臨床病例中，均能從患者血清或尿液等體液中分離exosome用(use)于(At)早期臨床診斷。腫瘤exosome也可用(use)于(At)腫瘤的(of)臨床風險或療效評估，以(by)及預後判斷。
1、可作(do)爲(for)胰腺癌診斷的(of)生(born)物标志物
2015年，美國(country)德克薩斯大(big)學研究者Sonia A. Melo等人(people)在(exist)Nature發布了(Got it)一(one)篇論文，報道了(Got it)他(he)們(them)基于(At)exosome标志物所建立的(of)一(one)套非侵入性的(of)胰腺癌診斷方法，這(this)種方法可以(by)非常精确地(land)從良性胰腺疾病中診斷出(out)早期癌變。雖然這(this)項研究還需要(want)在(exist)更大(big)群體範圍内驗證，但這(this)種新的(of)診斷方法已經展示出(out)非常大(big)的(of)應用(use)潛力，它可以(by)幫助醫生(born)更準确地(land)判斷是(yes)否需要(want)爲(for)病人(people)進行手術。這(this)套診斷方法主要(want)依靠檢測一(one)種錨定在(exist)血液中exosome質膜上(superior)的(of)磷脂酰肌醇聚糖-1（glypican-1，GPC1）來(Come)實現診斷效果[8]。
研究者從胰腺癌病人(people)血清中分離得到(arrive)的(of)exosome中發現了(Got it)這(this)種糖蛋白，但是(yes)在(exist)其他(he)良性胰腺疾病及正常人(people)的(of)血液中分離的(of)exosome中，GPC1的(of)含量非常低。數據表明，這(this)項檢測比傳統的(of)ELISA檢測糖抗原 19-9（CA19-9）更爲(for)可靠。實驗中，約有一(one)半的(of)非癌症病人(people)體内CA19-9水平也很高，但是(yes)沒有任何一(one)個(indivual)病人(people)體内出(out)現GPC1+ exosome，而且還有很多癌症病人(people)的(of)CA19-9水平沒有超過對照水平。之前已有研究發現胰腺癌細胞中GPC1會出(out)現過表達，且過表達的(of)GPC1會促進腫瘤增殖和(and)遷移。這(this)項研究首次證明，在(exist)血清中的(of)循環exosome可以(by)作(do)爲(for)一(one)種特殊标志物用(use)于(At)診斷癌症。不(No)過需要(want)注意的(of)是(yes)，如果不(No)對exosome進行富集，直接檢測血清中GPC1的(of)效果并不(No)比檢測CA19-9更有效，GPC1的(of)診斷效果需要(want)非常好的(of)exosome富集手段作(do)爲(for)支持。Melo和(and)他(he)的(of)同事們(them)則首先用(use)少量血清進行超速離心，再用(use)攜帶有GPC1抗體的(of)磁珠進行進一(one)步富集，最後用(use)流式細胞儀進行分析。這(this)種方法更适合在(exist)臨床實驗室中作(do)爲(for)常規檢測流程進行推廣。
圖4. 利用(use)外泌體GPC1對胰腺癌進行診斷示意圖
圖5. 利用(use)外泌體GPC1對胰腺癌進行診斷的(of)結果
2、可作(do)爲(for)黑色素瘤診斷和(and)預後的(of)生(born)物标志物
惡性黑色素瘤是(yes)一(one)種侵略性腫瘤，其發病率越來(Come)越高。近日發表在(exist)《臨床化學學報》（Clinica ChimicaActa）的(of)研究，西班牙科學家确定并評估了(Got it)exosome中黑色素瘤标志物的(of)存在(exist)，包括MIA、S100B和(and)酪氨酸酶相關蛋白2（Tyrp2）等，及胞外體中的(of)這(this)些标記物的(of)潛在(exist)臨床應用(use)價值[9]。實驗收集了(Got it)黑色素瘤IV期患者、非黑色素瘤患者和(and)健康對照人(people)群的(of)血清樣品。沉澱獲得exosome；對血清、胞外體和(and)無胞外體血清中的(of)TYRP2、MIA和(and)S100B的(of)濃度進行定量。結果顯示，在(exist)胞外體中檢測到(arrive)了(Got it)MIA和(and)S100B，并與血清濃度呈顯著相關（S100B: r = 0.968;MIA: r = 0.799; p < 0.001）。黑色素瘤患者胞外體中MIA和(and)S100B濃度顯著高于(At)健康對照人(people)群和(and)非黑色素瘤患者。然而，三組人(people)群血清胞外體中TYRP2的(of)濃度沒有差異。MIA的(of)ROC曲線分析所得峰下面積（AUC）爲(for)0.833（p < 0.01），S100B爲(for)0.840（p < 0.01）。胞外體中MIA濃度高于(At)2.5μg/L的(of)患者的(of)平均生(born)存期比胞外體中MIA水平低的(of)患者短（前者爲(for)4個(indivual)月，後者爲(for)11個(indivual)月，p < 0.05）。該研究證實，在(exist)MIA和(and)S100B黑色素瘤患者胞外體中檢測到(arrive)了(Got it)MIA和(and)S100B，對它們(them)的(of)量化具有診斷和(and)預後的(of)作(do)用(use)。
（三）Exosome與腫瘤轉移
1、百年假說終獲印證，exosome連接“種子”和(and)“土壤”
一(one)百多年前，Stephen Paget經過多年的(of)解剖學研究發現，特定的(of)腫瘤細胞總是(yes)傾向于(At)轉移到(arrive)特定的(of)組織器官，并于(At)1889年提出(out)了(Got it)著名的(of)“種子與土壤”轉移假說，認爲(for)腫瘤細胞隻能在(exist)适宜的(of)組織器官環境中才能形成轉移竈。由于(At)技術限制，該假說并沒有得以(by)證明。
來(Come)自美國(country)M.D.Anderson Cancer Center的(of)Dihua Yu等發現正常表達PTEN的(of)腫瘤細胞在(exist)腦部定植時(hour)，其PTEN的(of)表達會降低，當從腦部重新分離出(out)來(Come)後，其PTEN表達水平會恢複到(arrive)之前水平。進一(one)步研究發現腫瘤細胞轉移到(arrive)腦部後可以(by)被神經膠質細胞分泌的(of)exosome所改造，其exosome内部攜帶大(big)量的(of)miRNA-19a可以(by)靶向腫瘤細胞内的(of)PTEN mRNA從而影響腫瘤細胞内PTEN的(of)蛋白水平，進而影響CCL2和(and)NF-kB等通路促進腫瘤細胞的(of)增殖，提升腫瘤細胞的(of)抗凋亡能力[10]。這(this)一(one)發現，印證了(Got it)百年前Paget的(of)假說，腦部特定的(of)微環境正是(yes)适宜腫瘤“種子”生(born)長的(of)“土壤”。
圖6. Exosome參與構成适合腫瘤“種子”生(born)長的(of)組織“土壤”微環境
2、決定腫瘤轉移的(of)器官特異性
2015年《自然》（Nature）雜志上(superior)的(of)一(one)篇論文證實，腫瘤釋放了(Got it)數百萬攜帶着它們(them)的(of)蛋白質和(and)遺傳物質的(of)囊泡exosome，它們(them)确保了(Got it)受納器官做好接待腫瘤細胞的(of)準備。Exosome觸發了(Got it)受納器官中必要(want)的(of)分子反應—炎症、血管形成等來(Come)迎接腫瘤細胞，使得腫瘤細胞到(arrive)達後得以(by)增殖。這(this)是(yes)第一(one)項關于(At)腫瘤分泌的(of)exosome在(exist)器官特異性轉移中所起作(do)用(use)的(of)研究。在(exist)數百萬源自腫瘤的(of)exosome中，爲(for)什麽隻有少數将會優先選擇一(one)些器官築巢？是(yes)否因爲(for)腫瘤分泌的(of)exosome具有一(one)些特殊的(of)分子标記，以(by)某種方式引導至特定的(of)器官？爲(for)了(Got it)驗證這(this)一(one)假說，研究選擇了(Got it)來(Come)自大(big)約十種不(No)同腫瘤的(of)20個(indivual)腫瘤細胞系，已知其中的(of)一(one)些腫瘤轉移至特定靶器官：肺髒、肝髒、大(big)腦或骨骼。蛋白質組學研究分析了(Got it)腫瘤exosome中的(of)近1000種蛋白，發現exosome中整合素（integrin）α6β4和(and)α6β1在(exist)肺轉移中起關鍵作(do)用(use)；而exosome中integrin αvβ5 在(exist)肝轉移中起關鍵作(do)用(use)。如果下調integrinsα6β4和(and)αvβ5，能分别阻止肺和(and)肝轉移[11]。這(this)些蛋白存在(exist)于(At)exosome膜上(superior)。
圖7. Exosome決定腫瘤轉移的(of)器官特異性
3、作(do)爲(for)轉移瘤掠奪能量的(of)利器
來(Come)自City of Hope Beckman Research Institute的(of)研究者們(them)發現，癌細胞通過攜帶高水平miR-122的(of)囊泡在(exist)轉移前微環境中抑制非腫瘤細胞的(of)葡萄糖攝取，爲(for)即将轉移過去的(of)腫瘤細胞提供一(one)個(indivual)高葡萄糖環境，來(Come)維持腫瘤細胞高水平的(of)糖攝取。在(exist)體内，抑制miR-122可恢複遠端器官包括腦和(and)肺的(of)葡萄糖攝取，并降低腫瘤轉移的(of)發生(born)率。這(this)暗示着腫瘤exosome中miR-122可能是(yes)一(one)個(indivual)潛在(exist)的(of)藥物靶點[12]。
4、促進腫瘤侵襲和(and)擴散
Exosome促進腫瘤侵襲和(and)擴散主要(want)是(yes)通過EMT--上(superior)皮間質化。細胞通過EMT改變分子表型，改變形狀（細胞變爲(for)狹長導緻細胞縫隙鏈接強度下降以(by)及移動能力增強)。EMT主要(want)通過各種信号通路如TGF-β1, Wntproteins, EGF, HGF和(and)MMPs等之間的(of)相互作(do)用(use)而産生(born)。Exosome在(exist)腫瘤的(of)快速轉移也表現于(At)其參與血管的(of)形成。這(this)種機制與缺氧區域高度相關。Exosome蛋白質分析可以(by)發現IL-8和(and)VEGF（可參與新血管形成）表達量增多[13]。
圖8. 外泌體與腫瘤轉移（Zhang Y et al. Nat Cell Biol.2015;17:709-711.）
2014年，賓夕法尼亞大(big)學的(of)研究人(people)員在(exist)Cell上(superior)發表了(Got it)關于(At)exosome從基質細胞轉移到(arrive)乳腺癌細胞，從而調節其治療耐受性通路的(of)研究成果[14]。基質細胞和(and)乳腺癌細胞利用(use)旁分泌（paracrine）和(and)近分泌（juxtacrine）信号來(Come)啓動化療和(and)放療的(of)耐受性。Exosome中的(of)RNA成分，大(big)部分是(yes)非編碼轉錄本和(and)可轉移元件，促進RIG-I受體的(of)識别，從而激活STAT1依賴的(of)抗病毒信号通路。同時(hour)，基質細胞也能激活乳腺癌細胞的(of)NOTCH3。這(this)種旁分泌的(of)抗病毒作(do)用(use)和(and)近分泌NOTCH3信号通路在(exist)STAT1彙合從而促進NOTCH3的(of)轉錄和(and)治療耐受的(of)腫瘤起始細胞的(of)繁殖。抗病毒/NOTCH3信号在(exist)NOTCH信号通路和(and)基質介導的(of)耐受中的(of)作(do)用(use)，能被γ分泌酶抑制劑廢除。因此，基質細胞利用(use)exosome來(Come)介導抗病毒信号參與了(Got it)與乳腺癌細胞的(of)相互作(do)用(use)，能夠使乳腺癌耐受治療并重新起始腫瘤的(of)生(born)長。
圖9. Exosome促進腫瘤耐受治療并重新起始腫瘤的(of)生(born)長
三、腫瘤液态活檢的(of)最新技術---Exosome檢測平台
Exosome分析用(use)于(At)臨床診斷和(and)治療監控顯然是(yes)一(one)個(indivual)重要(want)領域。特定的(of)跨膜蛋白信号可以(by)識别腫瘤特異性的(of)exosome，而exosome内蛋白的(of)改變可以(by)用(use)于(At)推斷腫瘤對治療措施的(of)反應。雖然exosome有如此巨大(big)的(of)臨床價值，但是(yes)臨床日常exosome分析卻十分困難，主要(want)是(yes)因爲(for)目前缺少足夠靈敏且快速的(of)試驗平台，尤其是(yes)進行exosome蛋白質分析。傳統流式細胞儀無法測量不(No)到(arrive)300nm的(of)exosome；基于(At)微粒追蹤原理或動态光散射的(of)新型計數方法僅能提供有限的(of)分子信息；而傳統的(of)分子試驗（如WB、ELISA）需要(want)樣本量大(big)，無法适應臨床上(superior)的(of)持續分析、病人(people)數量龐大(big)以(by)及有限的(of)生(born)物儲備量等苛刻要(want)求。
（一(one)）目前臨床檢測exosome方法：
1、超速離心法
是(yes)最常用(use)的(of)exosome純化手段，采用(use)低速離心、高速離心交替進行（如圖所示exosome分離提取鑒定最原始最權威的(of)文獻[15]），可分離到(arrive)大(big)小相近的(of)囊泡顆粒。超離法因操作(do)簡單，獲得的(of)囊泡數量較多而廣受歡迎，但過程比較費時(hour)，且回收率不(No)穩定（可能與轉子類型有關），純度也受到(arrive)質疑；此外，重複離心操作(do)還有可能對囊泡造成損害，從而降低其質量[16]。
圖10. 超速離心法分離exosome
2、密度梯度離心
在(exist)超速離心力作(do)用(use)下，使蔗糖溶液形成從低到(arrive)高連續分布的(of)密度階層，是(yes)一(one)種區帶分離法。通過密度梯度離心，樣品中的(of)exosome将在(exist)1.13-1.19g/ml的(of)密度範圍富集。此法獲得的(of)exosome純度較高，但步驟繁瑣，耗時(hour)。
3、超濾離心
由于(At)exosome是(yes)一(one)個(indivual)大(big)小約幾十納米的(of)囊狀小體，大(big)于(At)一(one)般蛋白質，利用(use)不(No)同截留相對分子質量（MWCO）的(of)超濾膜對樣品進行選擇性分離，便可獲得exosome。超濾離心法簡單高效，且不(No)影響exosome的(of)生(born)物活性，是(yes)提取細胞exosome的(of)一(one)種新方法。
4、磁珠免疫法
Exosome表面有其特異性标記物（如CD63、CD9蛋白）[17]，用(use)包被抗标記物抗體的(of)磁珠與exosome囊泡孵育後結合，即可将exosome吸附并分離出(out)來(Come)。磁珠法具有特異性高、操作(do)簡便、不(No)影響exosome形态完整等優點，但是(yes)效率低，exosome生(born)物活性易受pH和(and)鹽濃度影響，不(No)利于(At)下遊實驗，難以(by)廣泛普及。
5、PEG-base沉澱法
聚乙二醇（PEG）可與疏水性蛋白和(and)脂質分子結合共沉澱，早先應用(use)于(At)從血清等樣本中收集病毒，現在(exist)也被用(use)來(Come)沉澱exosome，其原理可能與競争性結合遊離水分子有關。利用(use)PEG沉澱exosome存在(exist)不(No)少問題：比如純度和(and)回收率低，雜蛋白較多（假陽性），顆粒大(big)小不(No)均一(one)，産生(born)難以(by)去除的(of)聚合物，機械力或者吐溫-20等化學添加物将會破壞exosome等，因此發表文章時(hour)易受質疑。
6、試劑盒提取
近幾年來(Come)，市場上(superior)已出(out)現各種商業化的(of)exosome提取試劑盒，有的(of)是(yes)通過特殊設計的(of)過濾器過濾掉雜質成分，有的(of)則采用(use)空間排阻色譜法（SEC）進行分離純化，也有的(of)則利用(use)化合物沉澱法将exosome沉澱出(out)來(Come)。這(this)些試劑盒不(No)需要(want)特殊設備，随着産品不(No)斷更新換代，提取效率和(and)純化效果逐漸提高，因而逐漸取代超速離心法并推廣開來(Come)。
(1) Exosome Diagnostics公司推出(out)全球首個(indivual)基于(At)exosome RNA的(of)液體活檢産品
2016年1月21日——外泌體診斷公司（Exosome Diagnostics, Inc.）宣布推出(out)世界上(superior)第一(one)個(indivual)從血液樣本分離和(and)分析exosome RNA（exoRNA）的(of)液态活檢産品：ExoDx™ Lung(ALK)。 ExoDx Lung（ALK）已在(exist)Exosome Diagnostics公司的(of)CLIA認證實驗室得到(arrive)驗證，是(yes)一(one)種基于(At)血漿exosome的(of)診斷産品，可靈敏、準确、實時(hour)檢測非小細胞肺癌（NSCLC）患者的(of)EML4-ALK突變。Exosome Diagnostics公司專有的(of)exosome RNA提取平台提供了(Got it)檢測如EML4-ALK基因融合的(of)方法，相比cfDNA更直接、更靈敏。通過比較病人(people)組織ALK水平和(and)相應的(of)血漿樣本發現該測試顯示出(out)88％的(of)靈敏度和(and)100％的(of)特異性。
(2)用(use)于(At)exosome分析的(of)集成磁電化學感受器[18]
IMEX将兩個(indivual)正交的(of)磁性選擇系統和(and)電化學檢測系統結合。使用(use)小磁珠捕獲exosome，捕獲的(of)exosome通過電化學傳感器檢測。IMEX的(of)優點：①.細胞特異性的(of)exosome可以(by)不(No)進行過濾和(and)離心分離而直接從血漿中分離；②.通過磁性富集與酶聯放大(big)達到(arrive)高敏感性；③.通過電流探測的(of)機制，傳感器可以(by)迷你化再并聯進行測量。
圖11. 集成的(of)磁電化學外泌體檢測平台
IMEX的(of)工作(do)原理
第一(one)步、用(use)表面帶有抗體小磁珠捕獲exosome；
第二步、将帶有HPR（氧化酶）的(of)二抗作(do)用(use)于(At)exosome；
第三步、與TMB（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine）混合産生(born)電流。
使用(use)磁珠顯著簡化了(Got it)試驗程序，捕獲的(of)exosome可通過磁力收集并提升試驗的(of)敏感度，不(No)能被結合的(of)過量抗體、酶可被洗去。
(3) 腫瘤exosome的(of)新一(one)代測序分析
MD安德森癌症中心的(of)研究人(people)員從三個(indivual)胰膽管癌患者（兩個(indivual)胰腺癌、一(one)個(indivual)壺腹癌）的(of)體液中分離出(out)Exosome（Exosome）。使用(use)Illumina HiSeq2500測序儀對exoDNA、exoRNA進行全基因組、外顯子組和(and)轉錄組測序分析[19]。在(exist)exoDNA測序數據中檢測突變信号和(and)識别潛在(exist)可行的(of)突變，以(by)及在(exist)exoRNA測序數據中分析表達點突變和(and)基因融合。全外顯子組測序達到(arrive)95%-99%目标區域的(of)覆蓋，平均深度133-490 x。全基因組拷貝數情況，和(and)腫瘤相關片段的(of)高估值（56%-82%），表明exosome中含有腫瘤細胞來(Come)源的(of)DNA片段。包括NOTCH1和(and)BRCA2在(exist)内的(of)多個(indivual)可操作(do)的(of)突變在(exist)患者exoDNA樣本中發現。此外，exosome的(of)RNA測序鑒别了(Got it)融合基因表達的(of)存在(exist)，這(this)爲(for)腫瘤新抗原的(of)闡明提供了(Got it)新的(of)方式。Exosome的(of)核酸成分的(of)拷貝數概況，點突變，插入，缺失，基因融合等突變特征可作(do)爲(for)檢測各種腫瘤來(Come)源的(of)生(born)物标志物。基于(At)exosome的(of)液态活檢可作(do)爲(for)臨床工具用(use)于(At)癌症診斷，治療性分層，和(and)療效監測，不(No)需要(want)直接腫瘤取樣，将大(big)大(big)造福人(people)類健康。
圖12. 腫瘤exosome的(of)新一(one)代測序分析
（二）市場上(superior)的(of)exosome分離研究方法：
分離：商品化的(of)試劑盒如
TotalExosome Isolation Kit (from plasma) (Invitrogen™)
TotalExosome Isolation Kit (from urine) (Invitrogen™)
TotalExosome Isolation Kit (from from other body fluids) (Invitrogen™)
GS™Exosome IsolationReagent（for serum or plasma）(吉賽生(born)物)
PureExo® ExosomeIsolation Kit (for serum or plasma)（美國(country)101Bio）
DiagExo® Human Body FluidExosome Isolation kit（美國(country)101Bio）
DiagExo® Urinary ExosomeIsolation Kit（美國(country)101Bio）
研究：蛋白分離純化後做蛋白質組分析研究，RNA分離純化後做RNA sequence
優點：操作(do)便捷，可标準化，分離所得exosome純度和(and)濃度較高。
缺點：相關産品比較多，需平行比較，擇優選擇(目前還沒有已獲得FDA/CFDA認證的(of)試劑盒)。
（三）Exosome 分析
在(exist)下遊分析方面，分離純化出(out)來(Come)的(of)exosome可以(by)做蛋白分析，也可以(by)做RNA（microRNA和(and)LncRNA）分析。研究人(people)員通過Western blot或其他(he)方法來(Come)鑒定蛋白；利用(use)qPCR對microRNA表達譜進行分析；利用(use)芯片進行microRNA表達譜分析；利用(use)新一(one)代測序（NGS）開展microRNA/mRNA研究。
1、蛋白分析
（1）SDS-PAGE：通過SDS-PAGE電泳可以(by)分析得到(arrive)的(of)exosome中蛋白的(of)含量及種類。
（2）Western-Blot：通過Western-Blot可以(by)檢測exosome中特定的(of)蛋白表達情況。
（3）2-DE等蛋白組學分析：可以(by)了(Got it)解exosome中不(No)同蛋白的(of)表達、數量情況。
2、透射電鏡
通過透射電鏡可以(by)分析exosome的(of)大(big)小、形态等，再結合免疫标記可以(by)很清楚的(of)分析特定指标在(exist)exosome表達的(of)部位。
3、基因水平
（1）Real-Time PCR：通過PCR可以(by)分析需要(want)研究的(of)指标的(of)表達量
（2）轉錄組分析：通過測序或者芯片，分析exosome不(No)同基因的(of)轉錄水平
（3）miRNA ：通過測序或者芯片，檢測與exosome相關的(of)miRNA的(of)表達情況，研究特定的(of)miRNA
（4）lncRNA分析：通過測序或者芯片，檢測與exosome相關的(of)lncRNA的(of)表達情況，研究特定的(of)lncRNA與exosome共同調控某種疾病的(of)關系。
4、Exosome RNA研究策略簡介
（1）差異篩選對于(At)不(No)同類型Exosome RNA（mRNA、lncRNA或miRNA等）的(of)功能探索與一(one)般的(of)RNA分子功能研究方法并無本質區别。在(exist)進行差異篩選之前，首先要(want)進行exosome的(of)提取，可使
